1.引言

在分子量测定方法中，GPC 法（Gel Permeation Chromatography，凝胶渗透色谱法，）想必大家都比较熟悉。如今，该方法也被称为SEC 法（Size Exclusion Chromatography，体积排阻色谱法）。这类方法的原理是利用色谱柱内填充剂的孔径大小差异，使样品中不同成分的洗脱时间产生区别，进而实现分子量的测定。由于该方法需要通过与 “标准样品的洗脱时间” 进行对比来计算待测样品的分子量，因此最终得到的分子量被称为 “相对分子量”。

与之相对，光散射法则通过SLS 法（Static Light Scattering，静态光散射法）测定分子量。当光线照射到样品上时，溶质分子会产生散射光，而散射光的强度与溶质分子的分子量大小相关；同时，散射光强度也与溶质浓度存在关联。基于这一特性，通过分析不同浓度下测得的散射光强度，即可计算出样品的分子量。与 GPC 法不同，该方法无需依赖标准样品，因此最终得到的分子量被称为 “绝对分子量”。

该测定的直观理解方式是：以样品浓度为横坐标，以测得的散射光相关信息为纵坐标进行绘图。下文将展示 “聚苯乙烯（F40）溶解于甲苯中” 时的测定结果。

关于详细的计算公式等内容，我们计划在后续的内容中为大家介绍，因此本次暂不展开；但需要说明的是，通过相关分析我们能够得到一条直线 —— 该直线截距的倒数代表分子量，斜率代表第二维里系数。

表 1-1 汇总了上述两种方法的优点与缺点。

表1-1.　各测量方法的优点和缺点

SLS 法（静态光散射法）的一大优势在于，其无需使用色谱柱进行测定，因此对溶剂几乎没有限制。在 GPC 法（凝胶渗透色谱法，即 SEC 法 / 体积排阻色谱法）中，若样品与色谱柱填料发生相互作用，则难以完成准确测定；而 SLS 法只需将样品溶液装入玻璃比色皿即可进行测定，无需考虑 “样品与色谱柱的相互作用” 问题。此外，SLS 法不仅能测定绝对分子量，还可同步获取反映 “样品与溶剂亲和性” 的第二维里系数，以及体现 “高分子链空间伸展程度” 的旋转半径。

关于光散射测定的注意事项：由于散射光强度与粒子粒径的 6 次方成正比，因此样品中若含有微量杂质（如微小尘埃、未溶解颗粒等），会显著干扰测定结果。基于此，必须对测定样品进行 “光学级纯化处理”，以彻底去除这类杂质。相关纯化技术的细节，我们计划在后续内容中为大家介绍。

从本次开始，我们将以 “连载专栏” 的形式，不定期更新关于 “光散射技术在分子量测定中应用” 的内容。专栏计划涵盖的范围较广，不仅包括 SLS 法的测定方法、实操技巧，还将深入讲解数据解析相关知识。若这些内容能对大家的研究或学习稍有帮助，我们深感荣幸。

敬请期待下期专栏！

下期：

光散乱理论 …气体中与溶液中的散射理论公式、大分子的散射理论

2.光散射理论　…　气体中与溶液中的散射理论公司、大分子的散射理论

本次介绍静态光散射法（SLS 法）的分子量测定原理

当电磁波（光）照射到粒子及分子上时，粒子与分子中的电子会吸收能量并开始振动。这些振动的电子会向各个方向释放出电磁波（光），这一现象称为散射现象。

通过改变浓度和角度，对该辐射电磁波（散射光）的强度进行测定与分析，即可测量溶液中分子的分子量。

此外，本章会出现较多公式，因此如果您觉得“自己不太擅长公式……”，可以直接跳至3.SLS的测量方法部分阅读！

• 气体中的粒子散射
  这里首先考虑气体中粒子对光的散射。
  当入射光使用垂直偏振的激光时，散射强度（Is）与入射光强度（Io）的比值由下式给出。
  

  
  N：分子数
  λo：入射光的波长
  r：物质到检出器的距离
  α：分子的极化率 
  此散射强度与入射光波长λ的四次方成反比的公式被称为Rayleigh的λ⁻⁴定律。
  此外，极化率α可表示为下式:
  

  
  dn/dc：折射率的浓度增量
  M：分子量
  NA：阿伏伽德罗数 
  从这些公式可以看出，可以通过散射光的强度来求得分子量。
  

  
  

• 溶液中的散射
  在溶液中，需要考虑分子与溶剂的热力学相互作用，公式如下：
  

  
  R(θ) = Is·r²/Io 被称为瑞利比，通过设光学常数
  K = (4π²n²/λ₀⁴Nₐ)(dn/dc)²，通常可以表示为下式：
  

  
  

• 大粒子（分子）的散射
  当粒子的大小超过波长时，来自粒子各个部分的散射会相互干涉，从而使散射强度呈现出角度依赖性。将其表示为 P (θ) 函数时，公式如下。
  

  
  

  
  

• 重量平均分子量解析（以Zimm图为例）
  当分子量增大，或分子在溶液中伸展时，来自同一分子上多个点的散射光会发生干涉，从而出现角度依赖性。
  对于高斯链且存在分布的情况，散射强度可由转动半径（radius of gyration）<S²>¹/²（由转动半径平方的Z平均值<S²>得到）和重量平均的绝对分子量Mw近似表示。 
  使用散射矢量 q = (4πn/λ₀)·sin(θ/2)，可以将其整理成实际应用中更便于使用的图表形式。
  

  
  将 Kc/R(θ) 作为纵轴，sin²(θ/2) + Bc 作为横轴进行作图，就是 Zimm 图（B 为任意常数）。
  根据这个公式，将 Kc/R(θ) 对 sin²(θ/2) + Bc 作图时，通过向 c→0、θ→0 外推可以求得分子量 M；
  通过连接各浓度 θ→0 点的直线的初始斜率可以求得第二维里系数 A₂；
  通过连接各测量角度 c→0 点的直线的初始斜率可以求得转动半径 <S²>¹/²。
  以下是标准聚苯乙烯（TOSO 制 F-40）的苯溶液的例子。

图2-1.标准聚苯乙烯（TOSO 制 F-40(TS-85)；苯溶液）的 Zimm 图

下期

光散射理论 … SLS的测量方法 … 光学系的概念图和测量流程

3.SLS的测量方法　…　光学系的概念图和测量的流程

在静态光散射法中，将某一波长的光（激光）入射到样品上，测量分子散射光的强度作为散射角度（测量角度）的函数。装置的光学示意图如图3-1所示。

将测量样品放入圆柱形石英池中，并置于图中的恒温槽内。恒温槽中装有与石英池折射率相近的溶液（如硅油）。

来自光源（激光）的光入射到样品池，样品产生的次级散射光向各个方向发射。在与入射光成θ角（散射角度）的位置设置受光部，用于测量散射光强度。通过旋转受光部改变θ角，可以测量散射光强度的角度依赖性。

光源通常使用633 nm或488 nm等单色光。散射光强度的检测则使用雪崩光电二极管或光电倍增管。

常规测量中，入射光为垂直偏振，检测侧不使用偏振元件（这种配置称为Vv散射）。在检测器前设置针孔，以确保只检测来自样品池中心部分的散射光。

图3-1.　 静态光散射法的光学示意图

静态光散射法中使用的瑞利比（与测量条件无关的样品固有量）无法使用测量装置直接测量。

为了计算瑞利比，需要对瑞利比已知的标准物质（苯或甲苯；见表3-1）在散射角度90°下测量其散射光强度（校准测量），求出换算系数。

样品测得的散射光强度是溶质和溶剂散射光强度的总和。由于所需信息是溶质的散射光，因此需要分别测量样品和溶剂的散射光强度，然后用样品的散射光强度减去溶剂的散射光强度，得到过剩瑞利比（ΔRθ）。

将其乘以用标准物质求得的换算系数，即可得到绝对值。

表3-1.　标准物质的瑞利比

（25℃、Vv条件、单位：cm-1）

分子量的分析方法有多种，通常是从不同的散射角度和样品浓度分别求得 ΔRθ。关于解析方法，请参见后文。

计算分子量的参数之一是示差折射率增量（dn/dc）（折射率的浓度增量），该值需使用示差折光计单独测量，而非静态光散射装置。

与其他许多光谱法相比，光散射测量中无色低分子杂质对测量结果的影响较小；但另一方面，来自灰尘等大颗粒的强散射光会成为产生较大误差的原因。

为了去除这些杂质，需要对测量溶液进行适当的光学纯化处理，例如用合适孔径的膜过滤，或通过离心使杂质颗粒沉降后，将澄清的上清液转移到样品池中。

下期将介绍获得高精度数据的测量技巧

表3-2.　光散射测量的流程

下一期：

光散射理论 … SLS的测量技巧 … 一般的SLS测量技巧

4.SLS的测量技巧　…　一般的SLS测量技巧

静态光散射法是将光（激光）入射到测量样品上，用检测器测量样品散射出的光强度（散射光强度）。

因此，如果样品以外的散射光到达检测器，就会得到错误的数据，导致好不容易测量的数据无法使用。

本次将介绍避免这种情况的技巧。

１．测量前的注意点

• 放入样品的比色皿（圆柱池）必须先目视确认表面无划痕、无污渍后再使用。
  

• 脏的比色皿要彻底清洗。将其在玻璃器具专用清洗液中浸泡2小时至一昼夜，然后用缠有镜头纸的棉签等仔细擦拭池内部，去除污渍。最后用水冲洗并干燥。
  

• 测量前的比色皿需用经0.1μm过滤器过滤的丙酮清洗，预先去除灰尘。

 ２．样品制备的注意事项

• 标准物质（苯、甲苯）以及用于稀释样品的溶剂，必须先进行光学纯化（注射器过滤或离心处理），去除灰尘等杂质后再使用。由于一次过滤往往无法完全去除灰尘，多次过滤效果更佳。
  

• 待测样品也必须进行光学纯化。此时需考虑样品的大小，选择孔径最适宜的过滤器。请参考表4-1作为选择标准。

  表4-1.　用于过滤标准聚苯乙烯（溶剂：苯）溶液的注射器过滤器类型

  

  使用注射器过滤器进行过滤时，不要让过滤后的液体滴落到容器中，而是将注射器过滤器的尖端靠在接收容器的壁面上，使滤液沿着壁面流下进行过滤。

  为了获得准确的分子量，需要使分子在测量溶液中完全溶解。如果存在未溶解物或微凝胶，在过滤器过滤时，这些未溶解物或微凝胶可能会被截留。

３．测量条件的注意点

• 要提高测量精度，需要在溶质浓度较低且散射角度较小的区域进行测量。 然而，低浓度会导致散射光强度减弱，而低角度则容易受到杂散光（来自样品池的散射光）和灰尘的影响，因此考虑到这些，实验精度可能会下降。 作为参考标准，溶液浓度应选择使散射光强度达到溶剂散射光强度两倍以上的浓度； 即使在光轴调整充分的测量装置中，散射角度也建议在20°以上进行测量较为安全。 对于样品为水溶液体系的情况，测量尤其困难，因此应选择更高浓度、更高角度的条件进行测量以确保安全性。

• 当样品为高分子电解质时，在纯水中分子内和分子间的静电排斥力非常强，难以进行准确的分子量测量。因此，通常会在水溶液中加入约0.1 M的低分子盐（如NaCl等）来屏蔽静电排斥力，然后再进行分子量测量。

４．测量时的故障

• 分子量解析时，R(θ) 值为负

  这是因为在样品过滤过程中，溶质被过滤器截留，导致样品的散射光强度低于溶剂的散射光强度。

  对策：重新考虑过滤膜的孔径大小。

• 即使提高样品浓度，散射光强度也不增强

  如果存在未溶解物或微凝胶，则它们可能在过滤过程中被截留。

  对策：重新考虑过滤膜的孔径大小，或改用更容易溶解的溶剂进行测量。

• 测量过程中散射光强度波动较大

  当溶质在溶剂中溶解不良，或存在未溶解物、微凝胶等时，散射光会出现较大波动。

  对策：重新考虑过滤膜的孔径大小，或改用更容易溶解的溶剂进行测量。 

下期预告：

SLS的解析方法 …各种作图方法的用法区分以及使用Zimm图进行分子量解析的示例

5.SLS的解析方法 …各种作图方法的使用区分以及使用Zimm图进行分子量解析的示例

在静态光散射法中，会根据分子量大小和分子形状选择适合的各种作图方法。

表5-1列出了这些作图方法的类型、适用示例及其特点。

表5-1　各种作图法的适用示例和特点。

注）Berry 图中，需要将角度和浓度分别进行作图。

下面介绍使用典型的Zimm图进行分子量解析的示例。

Zimm图的基本公式如下：

此处：
　R(θ)：瑞利比（还原散射强度）
ｃ：浓度
K：光学定数（=4π2ｎ2(dn/dc)2/（NAλ04）：在直线偏振光入射的情况下）
NA: 阿伏伽德罗数
λ0：真空中的入射光波长
ｎ：介质的折射率
dn/dc：折射率的浓度增量
P(θ)：内部干涉因子

将 Kc/R(θ)作为 Y 轴，浓度或角度(sin2(θ/2))作为 X 轴进行作图，通过将数据外推到 c->０、θ->０，可以从外推线的斜率求得旋转半径和第二维利系数，从截距求得重均分子量Mw。

以下分别说明它们的求法。

＜重量平均分子量与旋转半径的求法＞

对于多个浓度下测得的 R (θ) 值，先将其外推到浓度为零，然后考虑这种 R(θ)c->0 时的角度依赖性 P (θ)。

此时P(θ)被表示为 

使用 的近似值，带入

因此对于を  作图的斜率　，中的 （旋转半径：  ），可以从切片的重量平均分子量  Mw 求出。

図5-1．重量平均分子量与旋转半径的求法

＜重量平均分子量与第二维利系数的求法＞

当将各浓度的 R (θ) 外推到角度 0 时，P (θ) 等于 1，因此

由此，根据中对浓度 c 的图线斜率，在一次近似的情况下可以求得第二维里系数（A2），在二次近似的情况下可以求得第二维里系数和第三维里系数（A3）。另外，通过截距可以求得重量平均分子量 Mw。

图5-2．重量平均分子量与第二维里系数的求法

将这些解析汇总到一张图中的方法被称为Zimm图。

下图展示了标准聚苯乙烯（东曹制F-40：溶剂为苯）的测量示例。

图5-3．标准聚苯乙烯的测定示例 

下期预告：

第二维里系数・惯性半径是什么……说明与测量示例